人CC趨化因子配體5ELISA檢測試劑盒實驗操作

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人 (Human) CC趨化因子配體5 (RANTES/CCL5) ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用

試驗原理：
RANTES/CCL5試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知RANTES/CCL5濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。先將RANTES/CCL5和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中RANTES/CCL5的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存）   96孔配置   48孔配置   配制
96/48人份酶標(biāo)板   1塊板（96T）   半塊板（48T）   即用型
塑料膜板蓋   1塊   半塊   即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：4.0ng/ml   1瓶（0.6ml）   1瓶（0.3ml）   按說明書進行稀稀
空白對照   1瓶（1.0ml）   1瓶（0.5ml）   即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液   1瓶（4.0ml）   1瓶（2.0ml）   即用型
生物素標(biāo)記的抗RANTES/CCL5抗體   1瓶（6.0ml）   1瓶（3.0ml）   即用型
親和鏈酶素-HRP   1瓶（8.0ml）   1瓶（4.0ml）   即用型
洗滌緩沖液   1瓶（20ml）   1瓶（10ml）   按說明書進行稀釋
底物A   1瓶（6.0ml）   1瓶（3.0ml）   即用型
底物B   1瓶（6.0ml）   1瓶（3.0ml）   即用型
終止液   1瓶（6.0ml）   1瓶（3.0ml）   即用型
標(biāo)本稀釋液   1瓶（12ml）   1瓶（6.0ml）   即用型

人 (Human) CC趨化因子配體5 (RANTES/CCL5) ELISA 檢測試劑盒自備材料
1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
2．實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9．按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備
1．標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
4.0 ng/ml   （6號標(biāo)準(zhǔn)品）   原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
2.0 ng/ml   （5號標(biāo)準(zhǔn)品）   100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1.0 ng/ml   （4號標(biāo)準(zhǔn)品）   100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.5 ng/ml   （3號標(biāo)準(zhǔn)品）   100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.25 ng/ml   （2號標(biāo)準(zhǔn)品）   100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.125 ng/ml   （1號標(biāo)準(zhǔn)品）   100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 ng/ml   （空白對照）   原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

人 (Human) CC趨化因子配體5 (RANTES/CCL5) ELISA 檢測試劑盒操作步驟
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案
   標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）
A   4.0   4.0   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品
B   2.0   2.0   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品
C   1.0   1.0   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品
D   0.5   0.5   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品
E   0.25   0.25   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品
F   0.125   0.125   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品
G   0   0   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品
H   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品   樣品

局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

人 (Human) CC趨化因子配體5 (RANTES/CCL5) ELISA 檢測試劑盒結(jié)果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的RANTES/CCL5標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的RANTES/CCL5含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
3、檢測值范圍：0-4.0ng/ml
4、敏感度： 0.01 ng/ml

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