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PCR實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)凝膠涂布貨片狀條帶彌散的原因
發(fā)布時(shí)間： 2023-06-13 點(diǎn)擊次數(shù)： 5163次PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）,一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。PCR的原理：PCR的基本過(guò)程類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制，特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的Oligo引物。整個(gè)過(guò)程由變性-退火-延伸3個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
PCR實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散的原因如下：
（1）酶量過(guò)高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來(lái)源的酶。
（2）dNTP濃度過(guò)高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過(guò)高?？蛇m當(dāng)降低其用量。
（4）模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。
（6）循環(huán)次數(shù)過(guò)多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
（7）退火溫度過(guò)低。
（8）電泳體系有問(wèn)題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒(méi)有凝固好；
③瓊脂糖質(zhì)量差。
（9）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。
（10）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。
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