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研域生物帶你繞開ELISA試驗中呈現(xiàn)的各種問題
發(fā)布時間： 2019-06-11 點擊次數(shù)： 1721次ELISA是蛋白定量的金規(guī)范，也是免疫學研討中常用的試驗辦法之一。很多人覺得ELISA很簡單，其實不然。今天研域生物帶你繞開ELISA試驗中呈現(xiàn)的各種問題，輕松搞定ELISA試驗~
1.間接法
檢測抗體常用的辦法, 首要用于對病原體抗體的檢測。
優(yōu)勢：二抗能夠加強信號，并且有多種挑選能做不同的測定剖析。不加酶符號的一級抗體則能保存它多的免疫反應性。
缺點：交互反應發(fā)生的機率較高
2.雙抗體夾心法
檢測大分子抗原常用的辦法。
優(yōu)勢：高活絡、高專一性，抗原無須事前純化。
缺點：抗原必定得具有兩個以上的抗體結(jié)合部位。
3.競爭法
檢測小分子半抗原（藥物、激素等）。
優(yōu)勢：可適用比較不純的樣本，并且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。
缺點：整體的敏感性和專一性都較差。
常見問題剖析
Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色溶解規(guī)范品以及倍比稀釋時，未渦旋震動或不行充沛。
規(guī)范品溶解、倍比稀釋時均需求渦旋震動以保證充沛混勻。單純依托移液器重復吹打，效率較低、作用也不必定jia。
Q2.標曲和樣本均不顯色在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充沛接觸，導致顯色偏弱。
推薦孵育階段，運用ELISA的微孔板振蕩器，調(diào)至適宜的頻率，使抗原抗體充沛接觸，保證結(jié)合作用。假如排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。關(guān)于比較大意的新手，必定要做好符號和記錄，或者運用增加染料的ELISA試劑盒。
Q3.標曲顯色，樣本不顯色當樣本中意圖蛋白濃度極低或者樣本中攪擾要素較強，就無法檢測到?，F(xiàn)在ELISA仍然是蛋白檢測活絡度gao的辦法，與不同技能結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測活絡度。
關(guān)于意圖蛋白濃度特別低的樣本，能夠嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著必定能檢測到樣本濃度，只能說能夠提高樣本的可測率，并使成果愈加牢靠。因為通常用一般ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也愈加可信。
Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大這個問題就跟移液器和試驗者的操作有關(guān)了。移液器的運用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大；試驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確運用和維護。關(guān)于個人的操作可操練移液動作、加快速度，保證移液的精密度。
Q5.本底偏高，樣本值測不到標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(關(guān)于高敏ELISA能夠恰當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時分，本底過高會掩蓋意圖信號，導致無法測到樣本值。
在參加TMB顯色后，需實時觀察標曲顯se狀況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可停止反應。
Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋，核算得到的樣本值差異較大有時分咱們不清楚樣本中意圖蛋白的濃度怎么，應該怎么稀釋，那么咱們就會做下預試驗，確認稀釋倍數(shù)。但是有時分同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，核算得到的樣本值之間差異較大，應該挑選哪一個稀釋倍數(shù)呢？
這里觸及到了基質(zhì)效應。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應較顯著。而經(jīng)過稀釋后，攪擾要素也隨之稀釋，影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后，核算得到的樣本值挨近時，咱們就能夠以為在該稀釋梯度時，樣本中的攪擾要素影響較小，核算得到的值也是挨近真實的。但是這樣的稀釋是針對意圖蛋白濃度較高的樣本而言。關(guān)于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就愈加測不到了，此刻可依照廠家說明書推薦的加樣方法操作。
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用除非是共用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，乃至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包含規(guī)范品、規(guī)范品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，假如輕率運用其它試劑盒的組分，有可能對成果產(chǎn)生影響。
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